第二章　根与根茎类中药材种子质量检验方法

川牛膝

川牛膝为苋科植物川牛膝Cyathula officinalis Kuan的根。主产于四川天全、金日河、汉源、峨眉、洪雅及云南，湖南，湖北等地。有逐瘀通经，通利关节，利尿通淋功效。用于经闭癥瘕，胞衣不下，跌扑损伤，风湿痹痛，足痿筋挛，尿血，血淋等证。

川牛膝喜冷凉、湿润、光照充足，怕酷热、干旱。多栽培于1 200m以上的山地阳坡林缘，以黄壤深厚、肥沃的土壤为佳。种子直播，分春播和秋播，主产区一般采取高山春播或低山秋播。春播于惊蛰至谷雨，海拔低的地区可稍早，高山区可稍迟。秋播于9月前后。播种时按0.5kg种子与100kg火土灰，加适量清粪水拌和。

（一）真实性鉴定

从送检样品中随机数取400粒种子，鉴定时须设重复，每个重复不超过100粒种子。根据种子的形态特征，如种子大小、形状、颜色、光泽、表面构造、气味等，必要时可借助放大镜等进行逐粒观察，与标准种子样品或鉴定图片以及有关资料对照。

川牛膝种子形态特征：具浅黄褐色苞片，长3.1～5.2mm，直径1.3～2.5mm，内含1枚种子。种子卵圆形，有光泽，无毛，种皮赤褐色，长2.0～3.0mm，宽1.3～1.6mm，千粒重1.80～3.20g。

（二）水分测定

称取粉碎样品3.000g左右，每个样品2次重复，分别用高恒温（133±2）℃和低恒温（105±2）℃烘干 1～5h。结果发现，高恒温下烘干，乐山材料的含水量在1～5h差异不显著，宝兴材料在3h后无显著变化，综合考虑认为高恒温烘干3h为宜；低恒温下烘干，乐山材料的含水量在3h后无显著变化，宝兴材料在4h后无显著变化（图2-1，图2-2）。综合考虑，选择高恒温烘干3h作为川牛膝种子含水量测定方法最佳。

（三）重量测定

分别用人工手数和数粒机数考察了百粒法、五百粒法和千粒法。

t检验结果表明（表2-1～表2-6），人工手数和数粒机计数间无显著性差异。采用百粒法、五百粒法和千粒法测定种子重量，其变异系数以五百粒法最小，因此建议采用五百粒法。

（四）发芽试验

考察了不同发芽床、发芽温度和发芽前处理对种子发芽率的影响。

1.发芽床

纸上、褶裥纸间、海绵、沙上和蛭石5种发芽床，在25℃温度条件下进行发芽床的试验，结果见图2-3。方差分析结果表明，采用不同发芽床处理的川牛膝种子发芽率有极显著差异（P＜0.01）。多重比较结果表明，褶裥纸间效果最好，其他依次为海绵、沙上、蛭石和纸上，但褶裥纸间、海绵和沙上三种发芽床种子发芽率的差异未达显著水平，综合考虑实验操作及观察方便等因素，选择了褶裥纸间法。

2.发芽温度

分别于15℃、20℃、25℃和30℃条件下，在滤纸上进行发芽温度试验，结果见图2-4。方差分析结果表明，采用不同发芽温度处理的川牛膝种子发芽率有极显著差异（P＜0.01）。多重比较结果表明，25℃和20℃处理下发芽率显著高于其他处理，考虑到25℃下出苗较快，更整齐，选取25℃处理。

3.发芽前处理

分别对种子进行不作处理、清水浸种24h、去外壳和赤霉素（GA）（100mg/kg、200mg/kg、300mg/kg）浸种6h，结果见图2-5。方差分析结果表明，采用不同发芽前处理的川牛膝种子发芽率有极显著差异（P＜0.01）。多重比较结果表明，除去外壳的川牛膝种子发芽率极显著高于其他处理，其次为不作处理、清水浸种者极显著高于其余处理。考虑到川牛膝种子脱壳比较困难，生产中均不去外壳播种，选择不作处理方式。

4.初末次计数时间的确定

采用乐山和宝兴的两份材料按上述确定的方法进行发芽，每个材料取400粒，每个培养皿放100粒，4次重复，每天统计发芽数，连续统计14d，结果见图2-6。从图中可以看出，初次计数时间为第2天，末次为第7天，考虑到部分材料第9天仍有个别出芽，末次计数时间确定为第9天。

（五）生活力测定

分别采用红墨水法、BTB法和TTC法对种子生活力进行检验。

1.红墨水法

30～35℃浸种过夜，将种子沿胚的中线纵切成两半。100个半粒为1个重复，2次重复；或50个半粒为1个重复，4次重复。置0.2%红墨水中浸染10～15min。取出后清水冲洗，胚染成红色为有生活力的种子。

2.BTB法

取0.1% BTB溶液100ml置于烧杯中，加入1g琼脂，用小火加热并不断搅拌。待琼脂完全溶解后，趁热倒在4个干燥、洁净的培养皿中，使成一均匀薄层，冷却后备用。将30～35℃浸泡过夜的种子，100粒为1个重复，2～3个重复，将种胚朝下平放，间隔距离至少1cm。然后将培养皿置于30～35℃下培养2～3h，在蓝色背景下观察，种胚附近呈现较深黄色晕圈为有生活力的种子。

3.TTC法

考察0.1%、0.3%、0.5%和0.7% 4个浓度，染色时间1h、2h、3h和4h。30～35℃浸种过夜，将种子沿胚的中线纵切成两半。100个半粒为1个重复，2次重复；或50个半粒为1个重复，4次重复。将种子置于不同浓度TTC溶液中，30～35℃避光染色，胚染成红色为有生活力的种子。

结果表明，红墨水法染色的胚与子叶染色部位不够清晰；BTB法由于每次制作培养基较费工、费时，而且受培养基浓度和厚度等因素影响，重复性欠佳，判断黄色晕圈较困难。TTC法染色效果最佳。对TTC法不同浓度、不同处理时间下川牛膝种子生活力进行测定，结果见表2-7。方差分析结果表明，不同浓度TTC以及不同处理时间对测定川牛膝种子生活力有显著影响。多重比较结果表明，以0.1% TTC处理3h结果最佳（表2-7）。

（六）种子健康度检查

对两份种子分别采用以下4种方法处理：①随机数10粒种子，不作处理；②10粒种子置于20ml无菌水中，静置2h；③10粒种子置于20ml无菌水中，超声40min；④10粒种子置于20ml无菌水中，以130r/min振荡1.5h。分别将以4种方法处理后的牛膝种子接种于PDA培养基上，每个平皿接种10粒种子，重复3次。另将4种方法处理后的洗涤液分别稀释1倍、10倍、100倍，各移取1ml接种于PDA培养基上，重复3次。置于恒温培养箱28℃培养5d。

种子带菌率（%）=带菌种子数× 100/供试种子数

从上述4种方法处理后的牛膝种子中均能分离出真菌和细菌，从表2-8中可以看出，不同处理方法的种子带菌率与微生物种类差异明显，第一种处理方法，即不处理种子直接将其接种于PDA培养基上，分离得到的微生物多样性最丰富，真菌的种类最多，建议采用该法进行川牛膝种子健康度检查。此外，种子健康度检查试验结果还表明，从以上4种处理方法的洗涤液及其不同倍数的稀释液中均仅分离到细菌，且各种洗涤液中的细菌种类均较少，多为1～2种，其种类和数量随稀释倍数的增加而减少。