第一节　普通光学显微镜

普通光学显微镜按其构型可分为正置式和倒置式两类。在临床实验室中，正置式光学显微镜是血液、体液检验最常用设备。细胞培养等专业需长工作距离观察活体样品，将前者基本结构反向设定，把照明系统放在样品载物台上，成像系统置于其下，称为倒置显微镜。由于这两类显微镜光学原理和基本构件相同，因而以正置式光学显微镜为例予以阐述。

一、工作原理

显微镜有两组会聚透镜系统实现放大功能：即目镜系统与物镜系统。被观察的样品置于物镜的前方，经物镜作第一级放大并产生倒立的中间实像，实像再经目镜第二级放大形成人眼所观察的虚像。因此，通过目镜观察到的图像并不是样品本身，而是其被物镜放大之后的成像。35mm的幻灯片放映机有助于阐明显微镜的工作原理：幻灯片放映机在屏幕上投影一张被放大的胶片图像时，放大倍数与幻灯片的宽度、透镜焦距的长度以及投影仪与屏幕之间的距离存在一个函数关系。如一个35mm幻灯片（24mm×36mm）投影后宽度是1m，放大倍数（M）为：M=1 000mm/36mm=28，看到的投影图像比幻灯片宽度放大了28倍。如相同投影图像再通过×10放大装置来观察，整个放大倍数将是×280（28×10=280）。显微镜通过同样方式实现放大功能，即最终放大倍数等于物镜放大倍数与目镜放大倍数乘积。一般认为，由于受光学定律制约，光学显微镜最大的有效放大倍数为×（1 250～1 300）。

多数情况下，显微镜被视为具有放大功能，但真正有意义的是显微镜的高分辨率力。分辨率与放大率是两个不相同但相关的显微镜性能指标。因对图像高度放大并非都能清楚地显示样品结构，所以仅对图像放大是不充分的。可用光衍射理论解释分辨率机制，显微镜物镜数值孔径越大，就能看到越细微样品结构；同时，分辨率还与入射光波长及聚光镜数值孔径有关。生物光学显微镜理论上可达的分辨距离（d）可由下式计算：

式1-1中，λ为所用光线波长；NAo为物镜的数值孔径；NAc为聚光镜的数值孔径。

若光源平均波长为550nm，物镜和聚光镜的数值孔径分别达 1.3时，d=211nm（0.2μm）。

二、主要结构

普通光学显微镜基本结构由机械和光学两大系统构成（图1-1）。

（一）机械系统

显微镜机械系统作用是支撑、装配与调节光学构件和被观察样品。主要由镜座、镜臂、镜筒和物镜转换器、载物台、调焦装置等组成。

1.支撑构件

（1）镜座和镜臂：

通常组成一个稳固整体，形成显微镜结构基础。显微镜除用来支撑镜筒和动态调节装置外，许多光学系统构件如聚光器和显微照相装置等都可依附在镜臂上；镜座内通常装有透射光光源及照明光路系统和视场光阑。

（2）镜筒：

上端放置目镜，下端连接物镜转换器。从目镜管上端到物镜转换器螺旋口下端距离称为镜筒长度。目镜管多为倾斜式双筒，双筒内装有折光和分光棱镜，能把从物镜出来的一束成像光束等分成两份，分别由两个目镜作观察，以减轻眼睛疲劳。双筒间距离可在55°～75°范围内调节，以适合不同使用者两眼瞳孔距离。其中，一个目镜有屈光度调节（即视力调节）装置，便于两眼视力不同的观察者使用。带照相装置三目显微镜镜筒一般在右侧装有光束分配棱镜的拉杆，将其全部推入时只作观察，当全部拉出用于显微照相。

近来针对显微镜支撑构件推出了人体工程学设计理念，如镜筒保持一定角度，观察高度可调节50mm，以确保使用者可轻松、专注和有效工作。

2.动态构件

（1）物镜转换器：

通常安装在镜筒下端的滑插式燕尾槽座上，已作了准确对中校准。有3～6个物镜螺旋口，以便物镜按放大倍数高低顺序装配。

（2）载物台：

多用于安放以载玻片形式承载的样品。载物台上装有可在水平方向上作出前后、左右移动的调节装置，其刻度用来标记观察时在被检样品中所发现特定部位，便于再次查找。依工作要求和用途不同，载物台有各种类型和附加功能，如水平方向旋转，可使样品更好地与显微照相取景框相适配。移动和聚焦也能采用电子步进方式等。

（3）调焦装置：

显微镜主体结构上或同轴安装或分别装有粗调焦旋钮和细调焦旋钮。调焦旋钮转动时带动燕尾导板上下移动，导板上装有载物台托架和聚光器托架，使其趋向或远离物镜，达到调焦效果。

（二）光学系统

光学系统是显微镜主体部分，决定仪器使用性能。主要由物镜、目镜和光源、聚光器组成。

1.成像构件

主要包括物镜和目镜。

（1）物镜：

物镜直接决定显微镜的成像质量，安装在物镜转换器上，因接近被观察的物体而得名。物镜根据使用条件的不同可分为：①干燥物镜：分为低倍物镜（×10以下）、中倍物镜（×20左右）和高倍物镜（×40～65）。②浸液物镜：放大×90～100。根据色差与像差的校正状况，物镜分为消色差物镜（achromat）、萤石玻璃消色差物镜（neofluar）、平场消色差物镜（plan-achromat）和完善平场复消色差物镜（planapochromat）等（表1-1）。

在物镜上常可见两组数据，如×10物镜上标有10/0.25和160/0.17，其中10为物镜放大倍数，0.25为数值孔径；160为镜筒长度（单位mm），0.17为盖玻片标准厚度（单位mm）。物镜主要参数包括：放大倍数、分辨本领、数值孔径和工作距离。①放大倍数：指眼睛看到的像与对应样品的长度比。如放大倍数为×100，指的是长度1μm的样品，放大后成像的长度是100μm；②分辨本领：即分辨率或分辨力。由物镜数值孔径和照明光线波长决定，以分辨距离来表达。分辨距离越小，表示分辨率越高，即性能越好。可见光照明显微镜分辨率极限是0.2μm；③数值孔径（numerical aperture，NA）：也叫镜口率，与显微镜分辨率成正比，常用干燥物镜数值孔径为0.05～0.95，油浸物镜数值孔径为1.25；④工作距离：指当所观察样品最清楚时物镜前端透镜下面到样品盖玻片上面距离。物镜工作距离与物镜焦距有关，物镜焦距越长，放大倍数越低，工作距离越长。

（2）目镜：

是将物镜所成像作再次放大的光学构件，由上下两组透镜组成，上面透镜为接目透镜，下面透镜称为会聚透镜或场镜。目镜长度越短，放大倍数越大，目镜放大倍数与目镜焦距成反比，常见目镜放大倍数为5～16倍，以10倍目镜为必备。上下透镜间或场镜下装有光阑（其大小决定了视场大小）。由于样品正好在光阑面成像，往往示有对中标志；还可在此处放置目镜测微尺，用来测量所观察样品；也能在这个光阑上标有指针，以便指示某个细微特点。

2.照明构件

主要包括光源装置和聚光器。

（1）光源装置：

分为自然光源和电光源两大类。采用自然光源尚需安装反光镜，在临床实验室已较少购置；电光源装置构成包括灯室和灯座、卤素灯、集光与聚光系统及视场光阑。某些显微镜根据不同需要配置一组透射光滤色片安装在显微镜底座内，通过底座外按钮来选择，如色温转换滤色片、中性减光滤色片和某些单色滤片。

（2）聚光器：

也叫集光器，位于载物台下方聚光器支架上，起会聚光线作用，以增强样品照明。重要的是，应使聚光镜数值孔径与物镜数值孔径相适应，以取得最佳或最大分辨率；聚光器是照明系统中重要部件，由聚光镜和孔径光阑组成。

简单的阿贝聚光镜由两片透镜组成，有较好聚光能力，但在NAc高于0.60时色差球差就显示出来。优质多用途聚光器由一系列透镜组成，下方有一孔径光阑，对色差球差校正程度很高，能得到理想图像，其NAc值可高达1.4。NAc有一定可变范围，通常刻在上方透镜边框上数字是最大值，通过调节下部孔径光阑开放程度，得到此数字以下各种不同NAc，以适应不同物镜需要。

聚光器调节装置包括：①聚光镜调中螺丝：调中螺丝通常为一对，位于聚光镜托架前方左右侧，和环形燕尾槽中调中螺丝成“三足鼎立”之势，聚光镜可前后、左右调整，使聚光镜光轴与照明光路、成像光路合轴；②聚光镜托架上下调节装置：利用此调节装置，可使聚光镜上下调动，使视场光阑经聚光镜在样品视野中成像调到最为清晰。

三、技术评价

（一）照明方法

按照明光束形成方向，显微镜照明方式可分为“透射式照明”和“落射式照明”两大类。荧光显微术常用落射式照明，普通光学显微镜多用透射式照明，后者特点是：光线通过聚光镜穿透样品再射入物镜成像后以目镜放大观察。其分为两种方式。

1.临界照明（critical illumination）

简单光学显微镜采用临界照明，将光源发出的光直接经聚光镜后用于样品照明。由于光源经聚光器透镜成像与样品所在平面近于重合，当光源表面亮度不均匀，或明显地表现出细小结构，比如灯丝等，就会严重影响显微镜观察效果，这是临界照明缺点。补偿方法是在光源上方放置乳白色滤片和吸热滤片，使照明变得较为均匀和避免光源的长时间照射而损伤被检样品。

2.柯勒照明（Köhler illumination）

是现代显微镜普遍采用照明方式，其构件不同于临界照明系统。在光源某一点发出的光经特定集光镜后，将该点成像于聚光器前焦平面（光阑）上，再经聚光器成为平行光均匀照射样品。由于不直接采用光源，因而消除了临界照明中光照度不均匀缺点。

（二）目镜与物镜关系

目镜应与物镜配套使用，如平场目镜或可调焦高接点平场目镜与消色差平场物镜、特平场目镜与完善平场复消色差物镜或萤石玻璃消色差物镜配套使用，可达到最佳成像质量。物镜已分辨清楚的细微结构，如没有经目镜再放大，达不到人眼所能分辨界限，仍看不清楚；而物镜所不能分辨的细微结构，虽经高倍目镜再放大，也看不清楚。使用较大数值孔径的物镜，放大率及分辨力均较好，但视野、景深和工作距离较小，所以目镜和物镜及其性能参数既相互联系，又彼此制约，可根据观察样品性质和实验要求合理选用。

（三）技术应用

显微镜能将人眼不能分辨的微小物体放大成像，以供医学工作者提取组织和细胞微细结构信息，在临床实验诊断、疗效观察和预后判断等方面得到广泛运用。在临床实验室，采用生物光学显微镜对血细胞、骨髓细胞和脱落细胞进行染色涂片、肿瘤和微环境组织切片形态学观察；微生物检验的初级报告和人体分泌物、排泄物中有形成分识别也依赖于显微镜观察（图1-2），临床应用详见相关章节，此不赘述。

四、质量保证

（一）观察前质控

1.安装准备

①显微镜安装在坚固、平坦、干燥、避光和洁净工作台上，后面保持足够空间（≥ 10cm）；②不要在镜下垫有毡子之类柔软表面，否则不仅不稳固，还可能堵塞灯室通风口，造成过热或着火；③正确连接电源线，有效接地；④让电源线远离灯室，以免受热老化，甚至漏电；⑤室温5～40℃、相对湿度宜 ≤ 80%，额定电压±10%。

2.照明调试

照明系统调整水平直接影响显微镜分辨率和视场照明均匀性。照明调试完成后，应用柯勒照明系统时只能通过调节光源电压以营造出合适视场亮度，而不应用调节聚光镜孔径光阑和聚光镜位置高低方法予以改变。在实际操作中，习惯调节聚光器孔径光阑和高低位置来改变显微镜的视场亮度，特别强调这是由于历史上对聚光器的误解所造成的错误用法。

（二）观察中质控

使用原则：①搬动显微镜时，应一手托住镜座，一手抓紧镜臂，千万不能让载物台、调节旋钮等受力；②转换物镜时应执其旋转碟滚花边转动，不要用手指推动物镜而直接使其受力，否则会逐渐使光轴歪斜，影响成像质量；③非厂家授权技术人员不要拆开显微镜任何部件，因为重新装配可能会导致性能降低；④不要将金属物品插入显微镜光学装置中，以免形成划痕等使设备损坏，或造成触电等致人身伤害；⑤工作中随时用专用纸或布轻轻擦拭清洁玻璃部件；⑥若要除去油渍等污物，宜蘸用少量的乙醚和乙醇混合液（7：3）擦拭。

（三）观察后质控

显微镜使用完毕后应进行适当处理和清洁程序后方可存放。首先将亮度调整到最小，并关闭电源。将载物台上样品取下，以擦镜纸擦净物镜前端；如曾使用浸油物镜，在擦镜纸上滴1～2滴醚醇清洗液，将粘有镜油部位擦拭干净。将物镜旋转到八字形位置。用绸布擦拭载物台和显微镜镜身，盖上防尘罩。

（四）维护保养

1.良好的保养习惯

显微镜对潮湿、高温、灰尘、腐蚀气体等因素十分敏感，因此除设置满意的显微镜工作环境外，操作人员还要有良好保养习惯。如显微镜内部落下尘埃、生长真菌极难清除，是影响成像质量主要因素，操作者必须随时注意。拧下物镜时，须将其旋座向下置放在干净台面上，或立即装入物镜盒中；拔出目镜时，随手用镜筒塞或干净纸帽盖上镜筒口；更换显微照相部件、光源时，随手盖好连接口盖，绝不留下可供跃入尘埃的空隙；拔出滤光片和插板时，即时堵塞插板孔。要有专柜放置显微镜，柜内须有吸湿变色硅胶，并按时更换。

2.光学部件保养

显微镜目镜和物镜是主要光学部件，装卸和保养时应格外小心，不得用手或硬物直接接触透镜。常规保养工具包括：①擦镜纸、脱脂棉；②醚醇清洗液；③吹气球等。

（1）目镜清洁：

目镜上灰尘用吹气球吹；手指印、唾沫、油脂，用清洗液擦拭：对小面积光学元件，用细塑料棒卷上脱脂棉，由中心向外、按螺旋形运动方向轻轻擦拭；对大面积光学元件用脱脂纱布或擦镜纸滴上清洗液，由中心向外、按螺旋形运动方向轻轻擦拭。

（2）油浸物镜清洁：

浸液物镜用毕后须及时清洁，否则镜油在物镜表面会凝结成硬膜，使物镜失去透明度而无法使用。低倍物镜由于孔大，深度浅，只需用擦镜纸蘸上清洗液，轻轻擦拭就能除去污垢。浸液物镜最前端通光孔极小须用细塑料棒卷上脱脂棉蘸上清洗液多次擦拭，用放大镜仔细检查通光孔四周是否残留浸液，否则会减小物镜数值孔径，影响物镜正常功能。

（3）光源保养：

普通光学显微镜卤钨灯，既要注意不要高频率开关，也要注意不能用完后长期不关，两者都易损坏卤钨灯。注意散热系统各种条件，包括室内温度。

3.显微镜机械部件保养

显微镜机械部件很少出现破损，但常出现自然磨损或由于使用者操作粗暴而产生灵敏部件故障。如螺旋、齿轮、齿条、物镜弹簧、光阑叶片、相机快门等失灵。如旋动螺旋调节某些部件时，操作者搞错旋动方向，或旋动到尽头仍用力过大旋得过紧造成失灵；或之前涂抹的润滑油年久干涸，使旋动阻力增加等。

显微镜使用者应了解所用仪器各部件构造原理。凡是金属制旋动、转换、滑动、推拉、研磨部件，可定期使用纯净苯、二甲苯有机溶剂擦拭，其后涂抹适合于各类部件相应标号的润滑油。如驱动滚珠部件用10号机械油（俗称黄油）；滑动部件用8号机械油；在光阑叶片宜用最稀薄润滑油（钟表油）；快门叶片不用润滑油，只要清除污物即可。香柏油、凡士林等易干涸油脂不可涂用。现代新型显微镜部件中以硬塑料代替金属部件，这些塑料部件上不能使用润滑油。

凡生产厂家出厂时涂有红色油漆螺丝不允许随意旋动。这种螺丝是固定光学部件基座螺丝“群体”。这类众多螺丝作用可分两类：一类是将基座拉向总体板块上固定螺丝；另一类是将基座推离总体板块支撑螺丝。只有两类螺丝所组成的力综合，才能使光学部件保持在准确光轴上。对非专业工程人员而言，随意旋动任何一个螺丝，就可能破坏整体光轴。

（王昌富　邓明凤）