第二节　百日咳鲍特菌

一、生长特征

百日咳鲍特菌为专性需氧菌，生长温度为20～37℃，最适生长温度为35～37℃，最适生长pH值为6.8～7.0。百日咳鲍特菌初次分离培养时对培养基营养要求较高，需要烟酸、半胱氨酸和甲硫氨酸等营养成分，但不需要X因子和V因子。细菌生长过程中可形成过多的脂肪酸，抑制细菌生长，对百日咳鲍特菌有毒性作用。培养基中通常加入10%～25%无菌脱纤维血、甘油和活性炭或离子交换树脂等物质，其中活性炭或离子交换树脂可吸收不饱和脂肪酸，促进细菌生长。

百日咳鲍特菌初次分离培养时常用B-G培养基，含甘油、马铃薯和血液等成分；也可用木炭琼脂（Regan-Lowe，部分商品名称为Charcoal agar）培养基，含有木炭、牛肉提取物、蛋白胨和血液等成分。在B-G培养基培养，35～37℃，需氧，培养3～5天，形成细小、光滑、圆形、凸起、银灰色、不透明、珍珠样的菌落，菌落周围有狭窄的溶血环；在Regan-Lowe培养基培养，可形成光滑、有光泽、水银样的菌落（图1-2-1）。百日咳鲍特菌在液体培养基呈均匀混浊样生长，可产生少量黏性沉淀。

百日咳鲍特菌为革兰氏阴性球杆菌，无动力，短小呈卵圆形，大小为（0.5～1.5μm）×（0.2～0.5μm）。单个或成对出现，短链排列，无芽孢和鞭毛。光滑型菌落，长时间培养后菌落出现不规则的多形性。革兰氏染色极易脱色（图1-2-2），用甲苯胺蓝染色时可见两极异染颗粒。

培养基营养成分或培养条件不适宜时，影响百日咳鲍特菌生长，百日咳鲍特菌多次传代后会发生由光滑型到粗糙型的相变（S-R变异）。百日咳鲍特菌分为4种不同的相变形态（Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ），其中Ⅰ相菌为S型，Ⅳ相菌为R型，Ⅱ相和Ⅲ相菌为S-R相的过渡状态，两者不存在时间上或进程上的必然联系。Ⅰ相菌有荚膜和菌毛，菌落光滑，毒力强，有狭窄的溶血环。Ⅳ相菌菌落大而粗糙，荚膜和菌毛消失，K抗原消失，无毒力，菌落呈白色，无溶血性。Ⅱ相和Ⅲ相菌的特点介于Ⅰ相和Ⅳ相菌之间。经多次传代后，百日咳鲍特菌对培养基营养的需求降低，血清琼脂或普通琼脂平板也可生长，但其毒力消失。非溶血性的细菌不能与百日咳患者血清发生凝集反应，因此制备疫苗时，应选用Ⅰ相菌株。

百日咳鲍特菌生化反应极不活跃，不发酵任何糖类，不液化明胶，不生成硫化氢，不产生吲哚，不还原硝酸盐，不利用枸橼酸盐，不产生尿素酶和苯丙氨酸脱氨酶；氧化酶阳性，70%以上菌株触酶（过氧化氢酶）阳性。

百日咳鲍特菌对外界理化因素抵抗力较弱，人体外只能短期存活。56℃条件下30分钟即可死亡，日光照射1小时、干燥3～5小时也可致死亡。低温环境中（0～10℃）可较长时间存活。百日咳鲍特菌对紫外线及一般化学消毒剂敏感，对多黏菌素、氯霉素、红霉素、氨苄西林敏感，对青霉素不敏感。

二、毒力因子与致病性

百日咳鲍特菌含有菌体（O）抗原和荚膜（K）抗原。O抗原为耐热抗原，是鲍特菌属的共同抗原；K抗原为不耐热抗原，是百日咳鲍特菌的特有抗原。K抗原又称K凝集原，是百日咳鲍特菌的表面成分，包括凝集因子1～6，其中，凝集因子1为百日咳鲍特菌特异性抗原。根据K抗原主要成分（凝集因子1、凝集因子2、凝集因子3）的不同组合，百日咳鲍特菌分为不同的血清型。

人是百日咳鲍特菌的唯一宿主。百日咳鲍特菌对人呼吸道纤毛上皮细胞有明显趋向性和黏附性，可进入上皮细胞，但一般不会穿透黏膜下层细胞侵入血液。百日咳鲍特菌产生的各种毒力因子可进入血液，共同作用产生生物学活性，引发百日咳疾病的发生（表1-2-1，图1-2-3）。百日咳鲍特菌的致病力与其毒力因子相关，毒力因子可大致分为黏附因子和毒素两类。黏附因子包括丝状血凝素、菌毛、百日咳黏附素、Ⅲ型分泌系统（type Ⅲ secretion system，T3SS）、脂多糖/脂寡糖和一些代谢蛋白（如BrkA、BapC和BatB）等。毒素主要包括百日咳毒素、腺苷酸环化酶毒素（adenylate cyclase toxin，ACT）、气管细胞毒素和皮肤坏死性毒素（dermonecrotic toxin，DNT）等。百日咳鲍特菌的毒力因子受到毒力表达系统（BvgAS）的调控，其中，BvgA是一种DNA结合调节因子，BvgS是一种135kDa的跨膜感受激酶。BvgAS双组分信号传导系统在百日咳致病性中起着关键作用，bvgAS基因可控制多种毒力因子的表达，包括百日咳毒素（pertussis toxin，PT）、腺苷酸环化酶（adenylate cyclase，AC）、DNT、丝状血凝素（filamentous hemagglutinin，FHA）、TcfA、Peractn、菌毛（fimbriae，FIM）、BrkA、BipA、BcfA和Vag8。

1.百日咳毒素

百日咳毒素（pertussis toxin，PT）是无细胞百日咳疫苗（acellular pertussis vaccine，aP）的主要成分，为百日咳鲍特菌的特异性外毒素，以往被称为促淋巴细胞增多因子。PT含有5个不同亚基（S1～S5），形成A、B两个亚单位，属于典型的A-B型结构细菌毒素（图1-2-4）。S1亚基（A原体）能破坏ADP-核糖与GTP结合调节蛋白的连接，不能下调环腺苷酸（cyclic adenosine monophosphate，cAMP）的表达，导致大量cAMP生成。A原体具有百日咳毒素的大部分已知生物学活性，包括：促进淋巴细胞增多，影响淋巴细胞的循环；激活胰岛素细胞，降低血糖；增强组胺敏感性，导致毛细血管通透性增加，引起低血压和休克；引起中国仓鼠卵巢细胞（Chinese hamster ovary cells，CHO）聚集生长。环状结构的B寡聚体由一个S2、S3、S5亚基和两个S4亚基组成，S5将S2-S4和S3-S4两个二聚体连接在一起。B寡聚体有助于百日咳鲍特菌黏附在呼吸道纤毛细胞上，具有一定的酶活性，可促进血细胞凝集，促使T细胞有丝分裂。A原体的主要酶活性依赖于完整的百日咳毒素分子，失去B寡聚体后，A原体将失去生物学活性。通过化学方法或分子生物学技术可灭活PT，使其失去毒性而保留其免疫原性。鲍特菌属的细菌中，仅百日咳鲍特菌产生并分泌PT，虽然副百日咳鲍特菌和支气管败血鲍特菌也携带百日咳毒素基因（ptx），但其相应启动子未被激活，转录处于静止状态，无法表达百日咳毒素。流行菌株和历史菌株的ptx基因测序分析表明，PT具有多态性，ptx基因可分为ptx1、ptx2等，目前流行菌株多为ptx1基因型。PT操纵子区的基因也具有多态性，对PT的表达进行修饰。

PT是百日咳鲍特菌主要的致病因子，可诱导机体免疫系统产生抗体，也可通过抑制中性粒细胞迁移和募集，使病原体避开抗体介导的清除作用，促进百日咳鲍特菌黏附于呼吸道纤毛上皮细胞，增强其黏附能力。PT具有细胞毒性作用，可刺激呼吸道纤毛上皮细胞导致阵发性痉挛咳嗽。另外，PT在引起机体急性感染、维持和延长感染期以及对抗抗体方面均可发挥作用。近年来研究发现，PT可抑制淋巴细胞归巢（B细胞和T细胞），以改变机体的固有免疫和适应性免疫，这也可能是百日咳容易出现继发感染的原因之一。PT是一种强免疫原，刺激机体产生的抗百日咳毒素的抗体是最重要的保护性抗体之一，并与免疫保护力有关。

2.丝状血凝素

丝状血凝素（filamentous hemagglutinin，FHA）是一种由367kD的前体蛋白经两端修饰和水解后形成的220kD丝状大分子蛋白，因其对红细胞有凝集作用而得名。FHA不具有酶活性，在百日咳鲍特菌最初黏附定植的过程中发挥重要作用。FHA可介导黏附素，促使细菌黏附到上呼吸道的纤毛上皮细胞。FHA有4个独立的黏附区域，协助细菌黏附于呼吸道纤毛上皮细胞、单核细胞、巨噬细胞和非纤毛上皮细胞，FHA缺失或突变的百日咳鲍特菌黏附能力减弱。FHA具有免疫调节功能，FHA与巨噬细胞受体相互作用，通过IL-10依赖机制可抑制早期炎症细胞因子IL-12的产生，从而限制保护性Th1的细胞应答，使病原体逃避机体的清除。FHA可促进人体单核细胞和呼吸道上皮细胞的炎症反应和细胞凋亡，也可与吞噬细胞表面的整联蛋白CR3（补体C3b的受体）结合，促进其被吞噬。进入吞噬细胞后，百日咳鲍特菌利用其他毒素（如腺苷酸环化酶毒素）破坏吞噬细胞的杀菌活性，持续寄生于吞噬细胞内。

FHA是一种强免疫原，具有很强的免疫原性，自然感染或接种含FHA的疫苗后可诱导机体产生抗FHA抗体，抵抗百日咳鲍特菌对呼吸道的致死性攻击。百日咳疫苗免疫后的学龄前儿童抗FHA抗体水平与预防百日咳发病相关。

3.菌毛

菌毛（fimbriae，FIM）是百日咳鲍特菌表面的细丝状聚合蛋白，具有辅助细菌在动物或人体气管内定植的作用。无菌毛的百日咳鲍特菌，因不能在小鼠鼻咽部和气管定植而无繁殖能力。支气管败血鲍特菌虽然也具有丝状血凝素及其他黏附因子，但也因缺乏菌毛而不能在动物的气管内定植。自然发病或接种含菌毛蛋白的疫苗后，血清中均可检测到抗菌毛抗体。体外连续培养传代会使百日咳鲍特菌的血清型发生转换，百日咳病程中血清型也会发生转换。英国血清流行病学数据显示，1941—1953年百日咳鲍特菌流行株含有凝集因子1、凝集因子2和凝集因子3，但1968年，75%的分离株仅含有凝集因子1和凝集因子3，其原因可能是疫苗免疫对流行株起到筛选的作用，在之后的疫苗中增加凝集因子3的含量后，增强了疫苗的免疫效力。世界卫生组织（World Health Organization，WHO）对于百日咳疫苗要求，疫苗要含有FIM凝集原，WHO推荐全细胞百日咳疫苗（whole-cell pertussis vaccine，wP）应包含FIM1、FIM2和FIM3，aP中也可能含有FIM2/3。抗FIM抗体水平与预防百日咳临床发病密切相关。

4.百日咳黏附素

百日咳黏附素（pertactin，PRN）是一种69kD的外膜蛋白，参与细菌与中性粒细胞和上皮细胞的黏附过程。副百日咳鲍特菌和支气管败血鲍特菌也含有PRN。百日咳PRN具有强免疫原性，自然发病或接种含PRN的疫苗均能产生抗百日咳PRN抗体。小鼠被动免疫抗百日咳PRN抗体后，可抵抗百日咳鲍特菌毒力株的呼吸道致死性攻击。

5.腺苷酸环化酶毒素

腺苷酸环化酶毒素（adenylate cyclase toxin，ACT）是一种具有腺苷酸环化酶结构域和重复子毒素（repeats in toxin，RTX）溶血结构域的蛋白毒素，大小为45kD。ACT能裂解红细胞，血琼脂培养基培养的菌落周围可产生溶血环，最初被认为是溶血素。腺苷酸环化酶由原毒素单体合成，原毒素分子经蛋白酶水解形成活性分子，有助于病原体进入真核细胞。在真核细胞内，该毒素发挥活性须有钙调蛋白的存在，细菌进入细胞，ACT被钙调蛋白激活，通过上调cAMP的表达而抑制巨噬细胞的氧化活性，抑制中性粒细胞的趋化、吞噬和杀伤活性，抑制NK细胞的溶细胞作用，其细胞毒性作用导致巨噬细胞凋亡。体内试验结果显示，腺苷酸环化酶的突变体不能引起致死性的感染，在感染过程中主要起抗炎和抑制吞噬作用。

6.气管细胞毒素

百日咳鲍特菌所产生的毒力因子中，仅气管细胞毒素（tracheal cytotoxin，TCT）可麻痹呼吸道黏液纤毛清除系统。TCT可与气管纤毛上皮细胞特异性结合，低浓度时可抑制纤毛的摆动，高浓度时可导致呼吸道纤毛上皮细胞坏死和脱落。TCT是百日咳鲍特菌细胞壁肽聚糖派生的成分，体外气管组织和细胞培养结果显示，TCT可引起细胞内线粒体肿胀，破坏细胞间的紧密连接，进而挤压纤毛上皮细胞。TCT亦能刺激细胞因子白细胞介素IL-1的释放，从而引起发热。

7.热不稳定毒素

热不稳定毒素因其在56℃可被灭活而得名，分子量140kD。动物实验显示，皮下注射热不稳定毒素可致外周血管收缩、白细胞渗出及出血，从而导致皮肤坏死，因此也被称为皮肤坏死毒素。腹腔或静脉注射该毒素可致动物死亡。热不稳定毒素存在于菌体内，当菌体破裂时释放，所有具备毒力的鲍特菌属细菌均能产生该毒素。该毒素是一种弱免疫原，相应抗体在动物攻击试验中没有保护性。

8.血清抗性蛋白A

血清抗性蛋白A（BrkA）是一种73kD的外膜蛋白，属于膜蛋白自转运蛋白家族。BrkA可抵抗补体系统，避免其受到经典补体激活途径造成的攻击。BrkA的C端跨膜结构域在菌体外膜上形成孔道，N端穿过孔道后，输出外膜并定位在菌体表面，可阻止或封闭抗体与靶菌体结合，抗BrkA抗体可增强对百日咳鲍特菌的杀伤作用。初次感染时，机体抗BrkA抗体产生缓慢，但再次暴露后很快上升。这可能是百日咳出现反复感染现象的一个原因。aP中不含有BrkA。

9.脂多糖/脂寡糖

百日咳鲍特菌细胞壁上具有脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）结构和脂寡糖（lipooligosaccharide，LOS）结构，脂寡糖在结构上比脂多糖缺少O抗原成分，但生物学功能基本类似。脂多糖/脂寡糖是特异性菌体抗原，能诱导IL-1，激活补体，导致发热和低血压等。