第二节　乙型肝炎病毒分子病毒学

一、乙型肝炎病毒基因组结构

HBV的基因组是已知DNA病毒中最小的，仅含3 200bp，组成独特的带有部分单链区的双链DNA环状模式。长链为负链（L-），几乎形成完整的环，其5'末端有蛋白与之共价相连。短链为正链（S+），长度因毒株的不同而变化较大。其5'末端有一段戴帽的寡核苷酸与之相连。因此长链和短链的5'端均不能被多聚核苷酸酶磷酸化。长链和短链的5'端位置是固定的，短链可长可短。尽管短链的3'端长度有不同，但通过正、负链的5'端的黏性末端（含250bp）互补，使HBV基因组DNA形成部分环形结构。在正、负链5'端互补区的两侧各有由 11 个核苷酸（5'TTCACCTCTGG3'）构成的同向重复（direct repeats，DRs），分别称为DR1和DR2，其中DR1在负链的5'端，DR2在正链的5'端。

HBV基因组非常独特，正链及负链DNA可分别编码，所有顺式调控序列均位于编码区内，无内含子。HBV DNA长链含有分别编码结构蛋白（pre-S、S和核心蛋白）以及复制蛋白（聚合酶和X蛋白）的4个ORF，编码区有广泛的重叠以充分扩大其编码容量（100%S、23%C、39%X基因分别与P基因重叠）。HBV基因组高度压缩，重复利用，使有限基因得到充分的利用（4个ORF的全长为4.7kb，而HBV DNA全长只有3.2kb）。这种基因组的结构特点在其他生物极为罕见。

二、乙型肝炎病毒基因组读码框及编码蛋白

HBV 基因含 4 个开放阅读框（open reading frame，ORF）：SORF、CORF、PORF、XORF。

（一）SORF及其编码蛋白

SORF长度为1 185bp，由S、pre-S1和pre-S2区组成，3个区各有起始密码子ATG，但共同合用S区5'端的终止密码子。S区位于HBV DNA核苷酸第155～832位，编码含有226氨基酸残基的包膜主要表面蛋白，又称小表面蛋白，即乙型肝炎表面抗原（HBsAg）。主要表面蛋白是HBV颗粒衣壳和小球形颗粒和管型颗粒的主要成分，含量最高，占70%～80%。主要表面蛋白是HBV感染后的第一个血清学标志。pre-S2区位于HBV DNA核苷酸第 3 205～154位，pre-S2区 +S区编码包膜中蛋白。pre-S1区位于 HBV DNA 核苷酸第2 848～3 204位，pre-S1区+pre-S2区+S区编码包膜大蛋白。完整的病毒颗粒同时含3种外膜蛋白，以主蛋白为主，中蛋白5%～10%，大蛋白可达20%。

外膜蛋白含B细胞和T细胞抗原表位，可刺激宿主免疫应答。病毒靠外膜蛋白附着和侵入细胞。外膜蛋白可促使病毒的成熟和分泌。大蛋白有调节作用，可调节HBcAg核移，可抑制小球形颗粒分泌、可引起泡沫化。pre-S1和pre-S2有反式激活作用。

（二）CORF及其编码蛋白

CORF的长度为639bp，编码HBcAg和乙型肝炎e抗原（HBeAg）。在CORF有2个起始密码子AUG。由CORF内部第2个起始密码子AUG转录翻译合成HBcAg，分子量为22kD。HBcAg是HBV的结构蛋白，是核衣壳的重要组成部分，为病毒颗粒子装配所必需。用常规技术无法在血清中检测出HBcAg，但在急性或慢性HBV感染患者的肝脏，能检出HBcAg。C蛋白由183aa组成，称为HBc/e蛋白序列。C蛋白由4个α螺旋组成，有2个内部螺旋形成反向平行的发夹。2个C蛋白单体形成1个二聚体，90个或120个二聚体亚单位装配成核心颗粒，电镜下可见的刺突即为暴露于表面的发夹结构。HBcAg B细胞表位可能位于或靠近这些刺突的表面。第78和143之间的序列以及半胱氨酸的交联参与二聚体的形成和装配过程。虽然半胱氨酸稳定核心颗粒，但并非病毒在体外复制所必需。C蛋白可分为2个区，即N端装配区至第144位，以及具有重要功能的富精氨酸区，位于颗粒的内部。C端区对前基因组RNA的结合和基因组的复制是必要的，并涉及核心蛋白的磷酸化和核转运。两区通过第145和第150位之间的氨基酸形成的绞链相连。

当从CORF 5'端第1个起始密码子AUG起始翻译时，所合成的蛋白称为前核心蛋白（precore protein，preC）。preC蛋白的N端含有19aa的信号肽。preC蛋白由信号肽介导进入内质网腔后，首先切去其中的信号肽，随后该蛋白富含精氨酸的C端在高尔基体中也被切除，形成成熟的HBeAg，分子量为17kD。HBeAg不是HBV的结构蛋白，不是病毒复制所必需，不插入到病毒颗粒子表面，而是分泌到细胞外，进入血液循环。HBeAg可在具有高滴度病毒的患者血清中检出。HBeAg可能参与免疫调节和复制调节。

（三）PORF及其编码蛋白

PORF长度为2 532bp，为HBV基因组中最长的ORF，它除了包含全部的SORF外，还与CORF和XORF有部分区域重叠。P蛋白介导前基因组RNA包装入核心颗粒，并在核心颗粒内合成HBV DNA基因组。它具有3种酶活性：DNA合成的引物酶（primase）的活性、依赖RNA（逆转录）和依赖DNA的聚合酶活性、RNA酶H活性。P蛋白的这些活性分别位于不同的区。N端为引物酶活性，接着是一段无意义的间隔系列，然后是聚合酶活性区，C端是RNA酶H区。在RT活性区，HBV聚合酶具有与其他RT酶共同的保守的残基［酪氨酸-甲硫氨酸-天冬氨酸-天冬氨酸（YMDD）］。

（四）XORF及其编码蛋白

XORF最小，长度为435～462bp，编码长度为145～154aa的可溶性细胞内蛋白，即HBV X蛋白（HBx），分子量为24～28kD。HBx是一种多功能蛋白，不仅具有广泛的反式激活功能，而且可以通过许多复杂途径参与细胞的凋亡、DNA修复的调控、与P53的相互作用以及促进细胞周期的进程等。因此HBx与HBV在宿主肝细胞中的复制和诱导细胞的转录、增生、转化和凋亡以及与肝细胞癌的发生、发展关系非常密切。现已明确HBx并不与双链DNA直接结合，其引起的诸多功能是通过蛋白与蛋白相互作用实现的。

三、乙型肝炎病毒基因的转录及调节

HBV 可转录为 4 种未经拼接过的 mRNA：3.5kb mRNA、2.4kb mRNA、2.1kb mRNA 和0.7kb mRNA。2.1kb mRNA合成外膜中蛋白和主蛋白，2.4kb mRNA主要合成外膜大蛋白，0.7kb mRNA合成X蛋白，3.5kb mRNA合成C蛋白和P蛋白，3.5kb mRNA含病毒编码的全部信息，是逆转录模板的病毒前基因组。

HBV基因组含4种启动子。S基因启动子（sp）有两个串联启动子，sp1位于HBV DNA 核苷酸第 2 219～2 780 位，可调节 2.4kb mRNA 的转录，sp2 位于 HBV DNA 核苷酸第2 809～3 152位，可调节 2.1kb mRNA 的转录。C 基因启动子（cp）位于 HBV DNA 核苷酸第1 643～1 849位，cp由上游调节序列（CURS）和基本启动子（BCP）两部分组成。X 基因启动子（xp）位于 HBV DNA 核苷酸第 1 235～1 374 位，调节 0.7kb mRNA 的转录。

HBV基因组含2种增强子，即增强子1（Enh1）和增强子2（Enh2）。Enh1位于HBV DNA 核苷酸第 1 070～1 234 位，Enh2 位于 HBV DNA 核苷酸第 1 627～1 774 位。增强子可提高启动子的转录水平。

四、乙型肝炎病毒复制周期

HBV感染周期大致可分为以下几个阶段：①感染性病毒颗粒感染肝细胞，病毒外膜与细胞膜融合，将核衣壳释放进入细胞质，在细胞质中脱去核衣壳；②病毒DNA基因组进入细胞质，为松弛环状 DNA（relaxed circular DNA，rcDNA），rcDNA 解脱正链 5'端连接的 RNA片段、负链5'端连接的末端蛋白，进入细胞核，在HBV DNA多聚酶作用下延伸正链，将各链的缺口封闭，转变成共价闭合环状 DNA（covalently closed circular DNA，cccDNA），利用宿主的RNA聚合酶，cccDNA可以作为转录模板合成4种HBV mRNA；3.5kb mRNA含病毒DNA序列上的全部遗传信息，进入病毒核心的RNA是病毒基因组逆转录的模板，也称为病毒前基因组RNA；③mRNA出细胞核进入细胞质，被翻译成各种病毒蛋白；④HBV前基因组RNA与2种基因产物相互作用，形成未成熟的含RNA的核衣壳；⑤在衣壳内，在HBV逆转录酶的作用下，以3.5kb前基因组RNA为模板，逆转录出全长HBV负链DNA，同时在RNA酶H作用下RNA链被水解，由DNA多聚酶再合成互补的正链DNA；⑥DNA基因组即可重新进入细胞核，又可通过与表面蛋白相互作用，进入分泌途径的前高尔基腔，以有包膜的病毒颗粒出胞，没有核衣壳的表面蛋白的芽生形成小球形颗粒和管型颗粒。