- 病毒性肝炎(第3版)
- 陈紫榕主编
- 3274字
- 2025-03-14 15:30:21
第二节 戊型肝炎病毒分子病毒学
一、戊型肝炎病毒RNA基因组结构
采用分子生物学手段对HEV ET 1.1的克隆及序列分析,使得HEV研究获得了突破性进展。在随后的几年里,分别完成了来自缅甸、巴基斯坦、尼泊尔、墨西哥、中国、非洲、美国、埃及等地区的人HEV及美国猪的HEV的部分或全部基因序列的分析。不同地区来源的HEV基因组结构基本相似,但基因序列有一定差异,同一地区HEV基因序列相对保持稳定。
HEV为正单链RNA病毒,全基因组长约7.2kb。5'端具帽状结构和长为27bp的非翻译区(UTRs),3'端UTRs含有48bp并具有polyA结构,全基因组含有三个部分重叠的 ORFs,分别为 ORF1、ORF2 和 ORF3。ORF1 起始于 5'端的 nt28,延伸 5 079nt,止于nt5 107 ;ORF2 起始于 ORF1 的 3'端的 nt38,延伸 1 980nt,止于 Poly(A)上游的 nt65 处,远端为Poly(A)尾,150~200个腺苷残基,增强病毒的感染性;ORF3含有369bp,5'端与ORF1轻度重叠(1nt),与 ORF2有广泛重叠(328nt)。全基因组的核苷酸构成比例为:A 17%,C 32%,G 26%,U 25%,G+C 58%。
病毒蛋白的表达动力学仍然不清楚,但是它们在感染人体和实验动物期间的表达已通过抗体被确定。ORF1中的UTRs区和58nt保守区容易折叠成保守的茎环和发夹结构,并且和α病毒同源序列一起被推测在HEV RNA复制中有着很重要的作用。最近Graff等提示ORF2和ORF3是分别从双顺反子(bicistronic)亚基因RNA上比较靠近的两个AUG开始翻译的,而在4型HEV中观察到的这种阅读框架差别的合理性仍然需要实验模型来确认。
二、戊型肝炎病毒基因分型
(一)主要基因型
由于不同地区的HEV基因变异较大,而同一地区的HEV基因序列相对较保守,因此其分布有一定的地区性。各地毒株在ORF2氨基酸序列上的高度同源性造成了HEV血清学上的相似性,目前多数看法认为世界各地HEV均为同一血清型,在各基因型病毒间的交叉保护实验也证实了这一点。
根据Fankhauser等提议采用一个大体与Norwalk病毒相似的分类标准,即将ORF2区的核酸变异不超过20%的分离株归为一个基因型,HEV至少可分为4个主要的基因型,这4个基因型有着独特的地区分布:基因1型包括亚洲和非洲的HEV毒株,是引起水源暴发流行和散发病例的主要原因;基因2型仅包括墨西哥HEV毒株和非洲的个别地方性毒株;基因3型包括北美、南美、欧洲的一些国家、日本和太平洋周边的一些发达国家的人和猪的HEV毒株;基因4型包括了中国大陆、台湾地区和日本的人和猪的HEV毒株;鸟类的HEV毒株已被建议归为新的基因5型,但仍然需要确认。
虽然HEV的一基因型主要分布于某一地区,但并不仅限于该地区,例如,最早发现于墨西哥的基因2型后来也出现在非洲地区。最近,基因1型HEV在美洲的古巴出现,而且在柬埔寨的猪体内也发现基因1型。
所有的HEV基因型显示了不同程度的基因组内部的差异,最近的一些报道表明这种差异导致病毒传播模式和疾病严重程度的差异。HEV基因1型的暴发流行是由于人-人之间粪-口传播的有效性造成的。基因3型和4型因为跨物种之间的传播效率很低,所以只在动物之间传播,偶尔感染人类,有自一生食猪肉的患者体内分离的HEV HE-JA4的序列经证实是猪HEV的swJL145株。最近研究显示基因4型可以引起比基因3型更为严重的肝炎,在一共感染的患者体内发现基因4型的病毒滴度更高。所以根据分子差异和感染宿主差异,将HEV分为两类:H类(human)仅分离于人类,包括HEV-1和HEV-2,可引起大规模戊型肝炎暴发流行;Z类(zoonosis)人畜共患,包括HEV-3和HEV-4,见于小规模流行和临床散发。
(二)基因分型的意义
HEV基因分型的研究,对于更好地了解HEV变异性和流行病学特征有重要意义,同时可以为寻找HEV共同抗原和通用性PCR引物,研制更加敏感、特异的HEV诊断试剂盒,研制行之有效的HEV基因工程疫苗及对HEV感染的预防和临床治疗提供重要的背景资料。
三、戊型肝炎病毒蛋白组分
(一)ORF1蛋白
HEV ORF1编码一个非结构大蛋白,包含数个可能与RNA复制有关的功能结构域,如:甲基转移酶、木瓜蛋白酶样半胱氨酸蛋白酶(PCP)、RNA解旋酶和RNA依赖的RNA聚合酶(RdRP)。体外转录翻译系统表达HEV的pORF1可得到全长的多聚蛋白,延长表达时间该蛋白可以产生分子量分别为78kD和107kD两种ORF1的特异产物。如果ORF1在昆虫细胞中翻译表达,细胞内具渗透性的半胱氨酸蛋白酶可以封闭其部分表达。ORF1中甲基转移酶的存在提示HEV有一“戴帽”的RNA基因组。HEV基因组上的5'甲基鸟苷残基是HEV易感性和复制所必需的。RdRP中的GDD结构域对于HEV的复制也很重要。在HEV基因组复制时,3'端非翻译区和polyA尾的两个预测的茎环结构是RdRP结合所需要的。除了甲基转移酶,ORF1中其他的可能成分都还未表达、纯化和生化特性研究。
(二)ORF2蛋白
HEV的ORF2编码660个氨基酸的衣壳蛋白(pORF2)并可以包裹病毒的RNA基因组。ORF2蛋白进入内质网中并可能在内质网中积聚。最近的重组子表达实验已确定pORF2的N糖基化位点,糖基化位点的突变会阻止感染病毒颗粒的形成并使病毒对猕猴的传染性降低。在昆虫细胞内重组的pORF2表达缺失N端111个和C端53个氨基酸残基的蛋白,分子量为56kD,并可以自我装配成病毒样颗粒(VLPs)。
自我装配的VLPs结构已通过低温电镜观察到并发现其壳粒主要由同源二聚体组成,酵母双杂交技术也证明了pORF2的自身结合。ORF2蛋白和HEV基因组的5'端76个核苷酸结合,这和其衣壳的包装功能一致。如果其N端后面的111个氨基酸发生缺失,则pORF2就会失去RNA结合活性。
病毒颗粒的ORF2蛋白的大小和糖基化情况仍然不清楚,目前该蛋白是否还有其他的非结构性功能也还不懂。
(三)ORF3蛋白
HEV的ORF3编码123个氨基酸的小蛋白。最近的研究推测pORF3可能翻译自双顺反子的亚基因组RNA且N端缺少9个氨基酸。pORF3并不是病毒体外翻译所必不可少的,但在注射HEV基因组RNA时,是病毒感染猴子所需要的。哺乳动物细胞内表达pORF3显示可以和细胞内的多种蛋白相互作用。通过结构域1和细胞骨架共定位并结合MAP磷酸激酶,结构域2可以和血液结合素即急性期血浆糖蛋白相互作用,P1区包含磷酸化的丝氨酸残基,除了墨西哥分离株外,该残基在其他所有的HEV毒株中高度保守,P2区包含PxxPxxP模序,可以结合含有SH3结构域的多种蛋白。
pORF3可能与细胞内多种路径的相互作用来调节宿主细胞环境,结合并抑制对细胞外信号调节蛋白激酶(ERK)具有高度特异负调控作用的MKP-3/Pyst1从而间接激活ERK,持续激活ERK可以使细胞产生生存和繁殖信号。在表达ORF3蛋白的细胞内发现高水平的己糖激酶和低聚物电压依赖阴离子通道(VDAC),这些物质会减弱线粒体死亡信号,ORF3蛋白可能作为HEV联系细胞内信号传导途径的接头,促进病毒的复制和装配。最近的研究发现pORF3定位于循环的初级内体中,延迟表皮生长因子受体(EGFR)内化后的信号通道,这可能滞后内膜信号通路并促进细胞生存,另一个效应是减少pSTAT3的核转移并减弱急性期反应。因此,pORF3可能通过减少宿主的炎症反应,进一步创造有利于病毒复制的环境。α1-微球蛋白和Bikunin的前体蛋白(AMBP)及它们的成体均被证明是pORF3的结合伴侣,pORF3表达细胞的α1-微球蛋白的分泌大大增加,因为α1-微球蛋白抑制免疫反应,所以其分泌增加提示可能保护病毒感染的细胞。因此pORF3主要通过两个途径发挥致病作用,其一是通过激活ERK提高细胞的生存,滞后内膜信号通路并减弱细胞固有的死亡途径;其二是通过减少应急反应蛋白的表达和增加α1-微球蛋白的分泌来下调宿主固有的免疫反应。
四、戊型肝炎病毒复制
(一)病毒受体与穿入
HEV在细胞上的受体和穿入过程仍然不清楚。最近的研究显示pORF2上有一自aa368~606的截短肽段形成的23nm的颗粒可以结合并穿入HepG2、Huh-7、PLC/PRF5和A549细胞,之后阻止这些细胞的进一步感染。结合HEV或其壳粒蛋白的细胞表面分子目前未知。
(二)复制周期
HEV的主要靶细胞是肝细胞,但在动物试验表明肝外组织如外周血单个核细胞、脾、淋巴结和小肠都有HEV的复制。在相似性和序列同源性的基础上,根据已知正单链RNA病毒的特征推测出HEV复制和基因表达的模型。复制周期大致如下:①吸附、结合并穿入适合的宿主细胞;②病毒基因组RNA脱去衣壳;③在宿主细胞的胞质中翻译产生ORF1编码的非结构多肽(nsP);④在病毒PCP的协助下,细胞蛋白酶裂解病毒的ORF1 nsP,病毒RNA依赖的RNA聚合酶(RdRP)以病毒的正链基因组为模板复制出负链中间体;⑤以负链中间体为模板,合成子代正链基因组和正链亚基因组;⑥和alpha病毒一样,与α病毒同源序列可能作为亚基因组的启动子翻译亚基因组RNA产生子代结构蛋白;⑦新产生的壳粒蛋白包装病毒基因组装配成子代病毒体,并以未知的方式离开宿主细胞。以上的复制模型还需要直接的实验证明。
(林旭)