8.免疫检查点分子VISTA的研究进展

共刺激和共抑制信号的平衡对调节抗原特异性T细胞免疫功能至关重要，使T细胞既可识别外来抗原产生免疫应答，又可耐受自身抗原。在T细胞介导的免疫应答过程中，共抑制信号可作为免疫检查点维持自我耐受和防止过度的组织损伤。细胞毒性T淋巴细胞抗原4（cytotoxic T lymphocyte antigen 4，CTLA-4）和程序性死亡受体1（programmed death receptor 1，PD-1）是最广为人知的免疫检查点分子，可在次级淋巴组织和局部外周组织表达，调节各种免疫反应，发挥抗肿瘤、抗微生物和自身抗原等作用。近年来，针对CTLA-4和PD-1的靶向抗体在某些肿瘤治疗中取得突破性进展，再次激发医学界对负性检查点分子的研究热情，利用抗体与负性检查点分子的结合以发挥免疫调控作用。

T细胞激活抑制物免疫球蛋白可变区结构域（V-domain immunoglobulin suppressor of T cell activation，VISTA），也称为PD-1H、DD1α、c10orf54、Gi24、Dies1、SISP1，是一种与PD-1和程序性细胞死亡配体1（programmed cell-death ligand 1，PD-L1）具有高度同源性的新型共抑制免疫检查点分子，在调节肿瘤、自身免疫性疾病和炎症性疾病中的免疫反应中可能具有重要作用。目前，学界对VISTA的认识仍较为有限，本文结合近年相关研究对VISTA的结构、表达状态、功能作用及其在肿瘤、炎症中的作用进行综述。

一、VISTA的结构和表达

VISTA是一种Ⅰ型跨膜蛋白，由一个N端免疫球蛋白（immunoglobulin，Ig）V结构域，一个约30个氨基酸的杆状结构，一个跨膜结构域和一个含95个氨基酸的胞质尾区构成。分子进化分析显示，VISTA分子与PD-1、CD28和CTLA-4具有相似结构，与PD-1最为相似。IgV结构域的分析结果显示，VISTA与PD-L1同源性最高。

生物信息学分析显示，人VISTA具有非常长的IgV类结构域，并包含独特的CC′环和大量组氨酸残基。VISTA呈现出非典型的IgV样拓扑结构，包括一个额外的“H”β链和“钳样”二硫键，这种结构可能会限制其在细胞表面的定向，明显有别于其他已知的IgV样结构域。尽管仅具有单个IgV样结构域，但VISTA胞外结构域（extracellular domain，ECD）较大（161个氨基酸），明显大于此前预测长度（137个氨基酸），也比其他IgV结构域长得多。VISTA的另一个独特特征是其ECD存在大量组氨酸。这些表面暴露的组氨酸簇对于其强大的T细胞活化抑制作用必不可少。VISTA的FG环区，由保守的组氨酸三联体组成，相当于CD28和CTLA-4的关键MYPPPY基序以及T细胞受体（T cell receptor，TCR）和抗体的互补决定区3（complementarity-determining region 3，CDR3）区。VISTA的组氨酸含量占细胞外残基的8.6%，比其他1型跨膜ECD高得多，相比之下，所有1型跨膜ECD中的平均组氨酸含量仅为2.4%。这些组氨酸大多数是保守的，这可能赋予了VISTA独特的功能。对VISTA的序列预测和建模显示，IgV结构域在B链和F链之间由典型的二硫键连接，其还具有额外4个恒定半胱氨酸（3个位于IgV结构域，1个位于杆状结构）。尽管保守的半胱氨酸残基可能有助于二聚化，但尚未鉴定出多聚体。

小鼠和人源VISTA胞质尾区的相似性高达90.6%，表明其扮演着极其保守的功能角色。在保守的胞质尾区，VISTA类似于CD28和CTLA-4。VISTA不具有经典的免疫受体酪氨酸抑制模体（immunoreceptor tyrosine-based inhibitory motif，ITIM）或免疫受体酪氨酸激活模体（immunoreceptor tyrosine-based activation motif，ITAM），这有别于其他B7共受体分子。VISTA在胞质尾区中部具有保守的Src同源体2（SH2）结合序列（YxxQ，可能结合STAT蛋白），VISTA还具有三个C端SH3结合区域（PxxP，两个在CD28，一个在CTLA-4）。仍需要进一步探究VISTA胞质尾区序列是否可以像CD28和CTLA-4一样招募SH2/SH3结构域衔接蛋白。

基础研究显示，小鼠VISTA mRNA在胚细胞发育阶段的胚胎干细胞中表达，可调节骨形态生成蛋白4（bone morphogenetic protein 4，BMP4）的信号转导，在体外可以调节干细胞分化。在发育完全的成年小鼠中，VISTA mRNA主要局限于造血组织，如骨髓、胸腺、脾脏和淋巴结。VISTA mRNA在肺和小肠表达水平也较高，可能是由于这些组织存在白细胞浸润。而在心脏、大脑、肌肉、肾脏、睾丸和胎盘等器官，VISTA mRNA表达水平较低但可以检测到。在造血组织内，VISTA蛋白在骨髓细胞中表达水平最高，包括巨噬细胞、髓样树突状细胞（conventional dendritic cell，cDC）、单核细胞和循环中的中性粒细胞。

在CD4+T细胞中，VISTA在初始T细胞和Foxp3+调节性T细胞（regulatory T cell，Treg）中表达最高。CD4+记忆T细胞也可表达VISTA，尽管强度略有降低。VISTA在CD8+T细胞和自然杀伤细胞（natural killer cell，NK cell）表面表达水平较低，但可检测到，而在B细胞中没有表达。另外有研究者发现，VISTA在应激反应中可作为p53的下游靶点，这表明VISTA可在DNA损伤的凋亡细胞表面被诱导表达。

与小鼠体内表达一致，VISTA在人体中的表达也主要集中于造血组织。骨髓细胞中的表达量最高，包括CD14dim CD16+和CD14+CD16+/-单核细胞、淋巴样和髓样树突状细胞，而在中性粒细胞中的表达量次之。与健康人相比，HIV感染者单核细胞中VISTA表达水平升高。与小鼠的T细胞相比，人体CD4+和CD8+T细胞VISTA中的表达水平接近，其在CD56loNK细胞上也有微弱表达。

二、VISTA的功能研究进展

VISTA与T细胞共抑制受体PD-1和配体PD-L1的IgV样结构域都具有同源性。这在结构上提示VISTA在T细胞反应中可能同时作为配体和受体。VISTA作为配体可抑制T细胞活化。体内抗原提呈细胞（antigen presenting cells，APCs）表达的VISTA和体外制造的VISTA-Ig融合蛋白均可抑制CD69、CD25、CD44和CD62L的活性，从而抑制CD4+和CD8+T细胞的早期活化。VISTA作为受体也可负性调节T细胞的活化。敲除CD4+T细胞的VISTA可以增强其抗原反应性，分泌更多的IFN-γ、TNF-α和IL-17A。

VISTA作为配体发挥功能的推测最初来源于体外实验，小鼠或人来源的CD4+和CD8+T细胞与VISTA-Ig融合蛋白共孵育并接受抗CD3刺激，细胞增殖减少，且IFN-γ和IL-2生成减少。也有实验表明，使用A20细胞过表达VISTA-RFP或VISTA转染的骨髓树突状细胞作为APCs，可使抗原特异性CD4+T细胞的增殖减少。从LP-BM5逆转录病毒感染小鼠体内分离的骨髓源性抑制细胞（myeloid-derived suppressor cells，MDSCs）可在体外以VISTA依赖的方式抑制B细胞增殖，并已通过VISTA缺陷小鼠和抗VISTA阻断抗体治疗证实。综合这些研究可知，VISTA可能与一个未知的相应受体结合负调控自身激活。

Chen等的研究证实了抗体作用于T细胞表面的VISTA可以直接抑制T细胞。在移植物抗宿主病（GVHD）的多个小鼠模型中，在术前1d和手术当天给予抗VISTA抗体（克隆MH5A）治疗可显著提高小鼠存活率，并减少脾脏和肝脏中供体CD4+和CD8+T细胞的扩增。由于内源性T细胞在治疗后早期数量无明显改变，人们认为这种抗体不会消耗VISTA阳性细胞，而是作为VISTA激动剂。此外，利用VISTA基因敲除小鼠的研究表明，VISTA在供体而非宿主T细胞上的表达对于抗体诱导的疾病抑制是必要的。这些发现表明，VISTA可以作为T细胞的负性检查点调节分子。靶向VISTA的不同抗体可能产生完全相反的效应，如克隆13F3可以阻断VISTA，从而提高免疫力，而克隆MH5A可以增加VISTA的表达，增强免疫抑制。这些抗体的特异性和效应仍需进一步评估，以确定抗VISTA抗体是发挥拮抗还是激动作用的关键。

由于VISTA在小鼠和人类的骨髓细胞中的表达水平都很高，推测VISTA可能除了作为T细胞的配体，还可能参与骨髓细胞的反向信号转导。CD14+单核细胞中短暂过表达人VISTA导致IL-6、IL-8、IL-1β和TNF-α的产生增加。这种活性需要细胞质结构域的存在，表明VISTA参与单核细胞的信号转导。此外，从HIV阳性个体中分离的CD14+CD16+单核细胞经活化后，以上这些细胞因子的mRNA同样高表达。尽管VISTA在胞质域缺乏明显的ITIM或ITAM，但蛋白序列包含潜在的蛋白激酶C结合位点和脯氨酸富集基序。此外，对树突状细胞中PD-L1和PD-L2的研究表明，这些配体的参与可产生细胞内效应。目前，需要进一步研究VISTA对髓系细胞的下游信号转导作用。

VISTA可能具有配体和受体的双重作用，且这两种作用并不相斥。事实上，体内外混合实验表明，在T细胞和APCs中的VISTA基因均敲除的情况下，可出现T细胞最佳激活状态。因此，在癌症免疫疗法的背景下，阻断抗体可以防止VISTA与T细胞上的潜在受体结合或通过直接靶向初始和效应T细胞上的VISTA表达，以防止其与潜在配体结合后传递负性调节信号。同样，VISTA激动性抗体可能会触发VISTA对T细胞和髓细胞的抑制活性，从而增强免疫抑制。

三、VISTA在肿瘤中的研究进展

长期以来，肿瘤的发生发展与宿主免疫之间的关系一直备受争议，人们的认知也在不断更新。从最初的免疫监视，免疫系统可以通过识别非自身抗原来识别并清除肿瘤，到目前人们认识到这种关系更加微妙和复杂。肿瘤免疫编辑是一个动态的过程，宿主免疫既可清除或至少可以抑制肿瘤生长，又可促进肿瘤生长从而导致临床显性肿瘤的逃逸。认识到宿主免疫可能产生有害影响，可以为某些完全依赖于激活抗肿瘤反应的免疫治疗失败提供深刻的反思。尽管活化的T细胞能引起强大的抗肿瘤反应，但在转运至免疫抑制的肿瘤微环境（tumor microenvironment，TME）时受阻。

免疫介导的肿瘤逃逸是一个广泛的主动机制网络，其中包括抗肿瘤机制，但又可使肿瘤逃脱免疫系统，促进肿瘤生长。TME免疫抑制是由多种因素共同作用的结果，负性检查点调节分子（negative checkpoint regulators，NCRs）传递共抑制信号抑制T细胞的反应。B7家族是Ig超家族中一类结构相关的共抑制分子。研究发现，B7家族分子在多种不同的人类肿瘤和小鼠肿瘤模型中表达上调。由于在多种肿瘤疾病中表现出惊人的临床效应，CTLA-4和PD-1-PDL1轴等NCRs已成为逆转免疫抑制的基本靶点。VISTA在TME中表达升高，也应包含在这组NCRs中，在免疫抑制机制中也可能发挥一定作用。

NCRs的表达在抗肿瘤宿主反应发展的许多阶段可经结构性致癌信号和适应性免疫抵抗等因素调控。VISTA是B7家族成员之一，有望成为免疫治疗的新靶点。与PD-L1可在肿瘤和造血系统中检测到不同，VISTA在体内的表达是构成型的，主要在造血系统中表达。在多个小鼠模型中，VISTA表达在TME中表达上调，并在形成抗肿瘤免疫中发挥关键作用。特别是在肿瘤浸润性髓系细胞如髓样树突状细胞和MDSCs，以及肿瘤浸润性Tregs中，VISTA的表达更高。在MDSCs中，与周围淋巴结相比，VISTA在肿瘤浸润的白细胞上表达增加近10倍。这表明某些因素（如缺氧）可能上调VISTA的表达。免疫细胞浸润的肿瘤组织具有大量VISTA表达，这提示了靶向VISTA用于肿瘤治疗的可能性。

多项临床前研究检验了VISTA在介导免疫抑制TME中的潜在作用。Wang等最初在小鼠纤维肉瘤模型中证实，VISTA在肿瘤细胞中过表达可显著增加肿瘤生长速度，这是因为VISTA的配体活性直接或间接影响T细胞免疫抑制。在放射疗法治疗神经胶质瘤模型中，VISTA-/-小鼠显示出比野生型小鼠更强的抗肿瘤特性，此特性由CD4依赖的机制介导，耗竭CD4可阻断此效应。Le Mercier等的研究表明，在多种不同的实体肿瘤（如B16/OVA黑色素瘤、B16/BL6黑色素瘤、MB49膀胱肿瘤以及TEN/BRAF诱导的黑色素瘤）模型中，单克隆抗体阻断VISTA可显著抑制肿瘤生长。值得注意的是，在同基因肿瘤模型中，针对VISTA的激动性抗体（诱导免疫抑制）并不能增强免疫功能。整体抗VISTA单药治疗（克隆13F3）可通过减少MDSCs和肿瘤特异性Tregs的数量重塑TME的抑制特性。此外，抗VISTA治疗可增加肿瘤浸润淋巴细胞（tumor infiltrating lymphocyte，TIL）的增殖，促进T细胞效应功能。最近，Kondo等研究了一个鳞状细胞癌模型，尽管抗VISTA抗体未能使肿瘤显著消退，可能是由于使用的抗体不同，但治疗显著增加了CD8+ T细胞的活化和效应功能。

此外，一项比较VISTA-/-、PD-1-/-和VISTA-/-PD1-/-小鼠的研究表明，PD1和VISTA检查点在抗原特异性反应和慢性炎症中是非冗余的，VISTA-/-PD1-/-小鼠在自发性免疫疾病的自身免疫加剧。因此，VISTA可作为PD-1通路阻断癌症的非冗余靶点，这可能意味着其作为治疗靶点的临床潜力。事实上，VISTA和PD-1似乎是TME中调节免疫抑制的非冗余途径，这有望为进一步的联合治疗提供依据。目前，已经存在多种途径来维持肿瘤微环境的免疫抑制，但联合免疫治疗的机制和效果仍需要更深入的研究。

四、VISTA在炎症中的研究进展

VISTA在炎症调控中也扮演了重要的角色，对T细胞、B细胞等都存在调节作用，但在各个不同的疾病模型中VISTA的调控对象、作用机制不尽相同。在对炎症的调控过程中，VISTA的作用对象十分广泛，其中研究最为广泛的是T细胞。阻断VISTA可以降低T细胞活化的阈值，引起T细胞的自发活化，从而诱导自身免疫性疾病的发生，同时还能增强T细胞对外来抗原的反应，增强免疫反应。VISTA对T细胞的调节大多通过调控细胞因子的产生和分泌达成，如CD71+VISTA+红细胞可通过TGF-β促进调节性T细胞的发育和功能表达。此外，VISTA也可调节一些特殊的炎症轴，如VISTA对树突细胞介导的炎症反应以及IL-17介导的炎症轴有着负性调控作用。

VISTA敲除小鼠在实验性自身免疫性脑脊髓炎中更易发生自身免疫反应，当VISTA敲除小鼠回交于狼疮易感品系的小鼠后，也更容易发生系统性红斑狼疮。

另一项研究显示，老年雌性VISTA敲除小鼠自发患上一种严重的自身免疫和炎症性疾病，表现为溃疡性皮肤炎和抗核抗体（ANA）升高型红斑狼疮。这些实验都表明，VISTA参与外周免疫耐受和负调控T细胞活化，但机制不明。

系统性红斑狼疮（systemic lupus erythematosus，SLE）动物模型实验发现，VISTA缺乏可促进小鼠SLE的发生发展，且在SLE小鼠中检测到VISTA表达升高。实验还发现，抗VISTA抗体（克隆MH5A，激动型抗体）可以改善SLE小鼠的严重程度，减轻皮损和中性粒细胞浸润等。在SLE小鼠模型中，抗VISTA抗体（克隆MH5A）治疗可以减少小鼠总CD3+T细胞数量，包括CD4+、CD8+和CD3+CD4-CD8-B220+ T细胞，也使淋巴结内中性粒细胞和浆细胞样树突状细胞（pDC）减少，但B细胞、单核细胞和经典树突状细胞（cDC）数量不受影响。VISTA激动型抗体治疗使小鼠促炎因子IFN-α、IL-1α、IL-2和M-CSF显著降低。以上都表明，VISTA可以负性调控机体免疫状态，对机体炎症状态进行调节，但具体机制仍需进一步探究。

五、小结

与其他免疫检查点分子相比，VISTA作为新发现的靶标分子，具有独特之处。其在T细胞免疫抑制上功能明确，与PD-1有着不同的信号通路。但是，其在多种疾病状态下的表达及功能调控仍有待明晰，其作为受体和配体的调控作用有待进一步阐明。此外，VISTA与其他免疫检查点分子联合靶向治疗在肿瘤、自身免疫性疾病、感染性疾病中的作用，可能具有广阔的应用前景。

（纪文焘　薄禄龙）

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